产品货号：
BTN14-55900
中文名称：
乙型肝炎病毒前基因组RNA荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)
英文名称：
Hepatitis B Virus Pregenomic RNA（HBV pgRNA）SYBR qRT-PCR Kit
产品规格：
50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本产品以染料法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的试剂盒。
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一种RNA病毒，会引起乙型病毒性肝炎，是一种以肝脏病变为主的传染病。临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分患者可有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌，对人体生命健康造成严重损害。
保存：-20℃，有效期一年。
一、稀释阳性对照(以101～106这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
二、样品RNA的制备
三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
四、数据处理
相关搜索：乙型肝炎病毒前基因组RNA荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)，乙型肝炎病毒前基因组RNA染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一种RNA病毒，会引起乙型病毒性肝炎，是一种以肝脏病变为主的传染病。临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分患者可有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌，对人体生命健康造成严重损害。
- 一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
- 根据乙型肝炎病毒前基因组RNA的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
- 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍。
- 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
- 本产品足够50次20μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。
| 组分 | 规格 |
| 2×qRT-PCR缓冲液 | 500μL |
| 10×qRT-PCR酶混合液 | 100μL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 乙型肝炎病毒前基因组RNA染料法qRT-PCR引物混合液 | 100μL |
| 乙型肝炎病毒前基因组RNA染料法qRT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL) | 50μL |
保存：-20℃，有效期一年。
一、稀释阳性对照(以101～106这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
- 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
- 在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头，在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头，在4号管中加入5μL 1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×104拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
- 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×104拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
- 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒RNA提取试剂盒，其使用手册可以从本公司网站www.bjbalb.com，通过搜索产品名称或产品货号BTN71001下载。
三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
- 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
- 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子关闭盖子后最后添加)：
注：个别qPCR仪器型号需要添加ROX染料校正，以消除管之间的光程差使其保持一致以使实验达到更准确的数据。成分 样品管
N+2个RT-PCR
阴性对照RT-PCR阳性对照
(1～6管)2×qRT-PCR缓冲液 10μL 10μL 10μL 乙型肝炎病毒前基因组RNA染料法qRT-PCR引物混合液 2μL 2μL 2μL
3样品制备所得RNA模板(来自于第6步) 6μL - - 稀释所得6个阳性对照(来自于第4步) - - 6μL 10×qRT-PCR酶混合液 2μL 2μL 2μL
需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus，建议终浓度500nM。
需使用ROX染料II的机型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000，建议终浓度50nM。 - 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
过程 温度 时间 RT(逆转录) 50℃ 15min 预变性 94℃ 2min qPCR反应
(40个循环)94℃ 15sec 62℃ 15sec 72℃ 30sec(采集SYBR通道的荧光信号) 按仪器预设程序进行熔解曲线分析
四、数据处理
- 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于36。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于36则为阳性。如果在36～40之间，可结合熔解曲线判断，若样品的熔解温度与阳性对照相同，该样本判断为阳性，否则为阴性。
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